Mikrobiol. Z. 2021; 83(5):3-10.
doi: https://doi.org/10.15407/microbiolj83.05.003

Лактозо-залежна індукція гена SEF1, який кодує транскрипційний фактор,
підвищує продукцію рибофлавіну у дріжджів Сandida famata

А.О. Цирульник¹, Д.В. Федорович¹, С.М. Собчук¹, К.В. Дмитрук¹, А.А. Сибірний^1,2

¹Інститут біології клітини НАН України
вул. Драгоманова, 14/16, Львів, 79005, Україна

²Жушувський університет
вул. Зельверовича 4, Жешів, 35-601, Польща

Рибофлавін (7,8-диметил-10-рибітил-ізоалоксазин, вітамін В2) є біосинтетичним попередником флавінмононуклеотиду і флавінаденіндинуклеотиду, які беруть участь у низці відновних реакцій, деякі з яких є необхідними для функціонування аеробних клітин. Флавіни залучені в низку реакцій енергетичного метаболізму, відповідь на оксидативний стрес, фотосенсибілізацію і активацію інших вітамінів, зокрема фолату і піридоксину. Рибофлавін є важливим біотехнологічним продуктом, річний ринок якого становить близько 250 мільйонів доларів США. Здебільшого він використовується як компонент кормових преміксів для тварин (80% від загального обсягу виробництва), у харчовій промисловості як барвник, у медицині як компонент полівітамінних сумішей і як препарат для лікування деяких захворювань. За останні два десятиліття виробництво рибофлавіну шляхом мікробної ферментації повністю замінило хімічний синтез. Головними промисловими продуцентами рибофлавіну є сконструйовані штами бактерії Bacillus subtilis і міцеліального гриба Ashbya gossypii. Низка видів дріжджів за умов дефіциту феруму здатна до надсинтезу рибофлавіну. За допомогою методів класичної селекції отримано штами, здатні до надсинтезу рибофлавіну при високому вмісті заліза. Однак механізми регуляції синтезу рибофлавіну за участю заліза до цього часу не з‘ясовані. Високий флавіногенний потенціал мають дріжджі Candida famata. Використовуючи класичні методи селекції та методи генетичної інженерії (надекспресія генів SEF1, RIB1 і RIB7, які кодують позитивний регулятор, перший і останній фермент синтезу рибофлавіну відповідно), сконструйовано генетично стабільний штам C. famata, який у біореакторі продукував 16 г рибофлавіну на літр культурального середовища. Однак продуктивність синтезу рибофлавіну ще залишається недостатньою для промислового виробництва цього вітаміну. Дослідження транскрипційної регуляції генів, залучених у синтез рибофлавіну, і використання сильних промоторів C. famata для конструювання ефективних продуцентів вітаміну B2 мають науковий і практичний інтерес. Мета. Метою даної роботи було покращити надсинтез рибофлавіну у наявних штамах C. famata у синтетичному і природному лактозо-вмісному середовищах. Методи. Виділення плазмідної ДНК, рестрикцію, електрофорез в агарозному гелі, електротрансформацію і ПЛР проводили за стандартними методиками. Вміст рибофлавіну визначали флюориметрично, використовуючи синтетичний рибофлавін як стандарт. Дріжджі культивували у стандартних середовищах YPD і YNB, які містили глюкозу або лактозу як джерела карбону, або на молочній сироватці. Результати. Сконструйовано штами дріжджів C. famata з додатковою копією центрального регуляторного гена SEF1 під контролем промотора гена LAC4 (кодує β–галактозидазу) C. famata. Досліджено вплив експресії гена SEF1 під контролем лактозо індуцибельного промотора гена LAC4 на продукцію рибофлавіну за різних умов вирощування. Встановлено, що рекомбінантні штами C. famata, які містять експресійну касету “pLAC4_cf-SEF1_cf”, мають в 1,6–2,1 рази вищий вихід рибофлавіну у середовищі з лактозою як єдиним джерелом карбону у порівнянні з батьківським штамом AF-4. Продукція рибофлавіну сконструйованими штамами при вирощуванні в колбах досягала 1,69 г/л. Висновки. Сконструйовані штами дріжджів С. famata, що містять додаткову копію гена SEF1 під контролем лактозо індуцибельного промотора LAC4, є ідеальною платформою для розвитку промислового виробництва рибофлавіну на побічному продукті молочної промисловості – сироватці.

Ключові слова: дріжджі Candida famata, рибофлавін, ген SEF1, промотор гена LAC4, молочна сироватка.

Повний текст (PDF, англ)