Mikrobiol. Z. 2021; 83(3):56-65.
doi: https://doi.org/10.15407/microbiolj83.03.056

Удосконалення гніздової ПЛР для детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Л.М. Іщенко¹, В.В. Недосєков¹, В.Д. Іщенко¹, О.Ю. Кеппл¹, В.В. Ткаченко¹, T.А. Ткаченко¹,
С.В. Мідик¹, T.В. Немова¹, С.Д. Мельничук², В.Г. Спиридонов³, В.О. Ушкалов¹

¹Національний університет біоресурсів і природокористування України
вул. Героїв Оборони, 15, Київ, 03041, Україна

²Інститут ветеринарної медицини НААН України
вул. Донецька, 30, Київ, 03151, Україна

³Китайсько-український науково-дослідний інститут
Чжуцзі, 311800, Китай

Згідно з протоколом Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин для діагностики лейкозу великої рогатої худоби методом полімеразної ланцюгової реакції необхідно застосовувати її гніздовий формат як найбільш чутливий. Однак висока чутливість одночасно є і її недоліком через високий ризик контамінації продуктами ампліфікації та, як наслідок – отримання псевдопозитивних результатів. Найбільш небезпечним етапом з огляду на контамінацію є електрофорез продуктів ампліфікації в агарозному гелі. Метою роботи було удосконалити гніздовий формат полімеразної ланцюгової реакції, який рекомендується протоколом Всесвітньої організації охорони здоров’я, шляхом проведення другої стадії методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, що дозволить зменшити ризик контамінації, оскільки не буде потреби у проведенні електрофорезу в агарозному гелі для інтерпретації результатів. Методи. Для першої стадії запропонованої модифікації полімеразної ланцюгової реакції було використано нуклеотидну послідовність праймерів, рекомендованих протоколом Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин. Для другої стадії полімеразної ланцюгової реакції проведено дизайн праймерів та флуоресцентного зонду на основі аналізу нуклеотидних послідовностей ділянки оболонкового гену відомих ізолятів вірусу лейкозу, включаючи українські ізоляти. Крім того, для другої стадії було проведено дизайн праймерів для ідентифікації гену, специфічного для великої рогатої худоби, що дозволяє контролювати процес екстракції нуклеїнової кислоти у кожному зразку. Результати. Досліджено різне співвідношення концентрації праймерів для цільової мішені та внутрішнього контролю та встановлено, що максимальна ефективність обох мішеней досягається за концентрації 5 рМ для вірусу лейкозу та 5 рМ для внутрішнього контролю. Проведено порівняльні дослідження 48 зразків крові щодо наявності вірусу лейкозу за допомогою запропонованої модифікації гніздової полімеразної ланцюгової реакції, гніздової полімеразної ланцюгової реакції, рекомендованої протоколом Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин та полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі з використанням праймерів, які використані для другої стадії запропонованої модифікації двостадійної полімеразної ланцюгової реакції. Панель зразків включала як позитивні, так і негативні зразки. Отримано 100% співпадіння результатів щодо наявності вірусу лейкозу з використанням запропонованої модифікації гніздової полімеразної ланцюгової реакції та гніздової полімеразної ланцюгової реакції, рекомендованої протоколом Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин. Порівнюючи результати, отримані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі та запропонованої модифікації гніздової полімеразної ланцюгової реакції, встановлено, що при використанні полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі було отримано 5 хибнонегативних результатів дослідження і 3 сумнівних результати, які потребують повторного дослідження. Характерною є різниця у значеннях граничного циклу Ct позитивних зразків. Так, при використанні полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі значення Ct було у межах 24–40 циклів, а за використання запропонованої гніздової полімеразної ланцюгової реакції – у межах 4–20 циклів, що значно полегшує інтерпретацію результатів дослідження. Висновки. Запропонована нами модифікація гніздової полімеразної ланцюгової реакції поєднує в собі рекомендації Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин щодо ідентифікації вірусу лейкозу за допомогою гніздової полімеразної ланцюгової реакції та зменшення ризику контамінації за рахунок проведення другої стадії в режимі реального часу, що є зручнішим у рутинній діагностиці. Крім того, ампліфікація гену, специфічного для великої рогатої худоби у запропонованій модифікації, дозволяє контролювати якість та кількість екстракції нуклеїнової кислоти та попереджати хибнонегативні результати дослідження.

Ключові слова: вірус лейкозу великої рогатої худоби, гніздова ПЛР, ПЛР в реальному часі.

Повний текст (PDF, англ)