Mikrobiol. Z. 2021; 83(3):14-23.
doi: https://doi.org/10.15407/microbiolj83.03.014

Екологічна роль антибіотика батуміна, синтезованого Pseudomonas batumici

В.В. Клочко^1,2, І.І. Ліпова^1,2, Н.В. Чуйко¹, Л.В. Авдєєва¹

¹Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
вул. Академіка Заболотного, 154, Київ, 03143, Україна

²Національний технічний університет України
«Київський політехнічний інститут ім. Ігоря Сікорського»
просп. Перемоги, 37, Київ, 03056, Україна

Вид Pseudomonas batumici, виділений з ризосфери евкаліпта у вологій субтропічній зоні, є продуцентом полікетидного антибіотика батуміну з високою селективною активністю щодо стафілококів. Згідно наших даних повного сиквенсу геному штаму P. batumici УКМ В-321, за біосинтез батуміну відповідає значна частина геному, яка містить 28 генів або близько 70000 пар нуклеотидів. Згідно сучасних уявлень, біосинтез енергетично затратних метаболітів, до яких, ймовірно, відноситься і батумін, виправдовує себе у випадку своєї поліфункціональності для продуцентів. Оскільки вид P. batumici є представником ризосферних бактерій – актуальним є дослідження ролі батуміну у взаємодії з рослинами та оточуючою мікробіотою. Мета. Встановити роль батуміну в екології ризосферного штаму-продуцента P. batumici УКМ В-321. Методи. Предметом дослідження був антибіотик батумін, синтезований штамом P. batumici УКМ В-321 та близькі йому за структурою мінорні компоненти, утворювані в процесі біосинтезу. Культуральну рідину штаму, отриману в умовах глибинного культивування, екстрагували хлороформом (1:2). Похідні батуміну отримували методом тонкошарової хроматографії, використовуючи силікагельні пластини (Merck, USA) в системі бензол:ізопропанол – 5:1; проявник – пари йоду. Аналіз отриманих сполук та визначення їх молекулярних мас проводили методом високоефективної рідинної хроматографії (Agilent 1200) із застосуванням мас-спектрометричного детектору (Agilent G1956B): колонка SB-C18 (Zorbax), рухома фаза – ацетонітрил:вода (55:45), температура колонки – 30 0C, швидкість потоку – 1 мл/хв, ізократичний режим, інжекція – 5 мкл; іонізація методом APCI. Для біоавтографії отриманих сполук і визначення мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) використовували тест-штами бактерій з Української колекції мікроорганізмів та відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України. Біоплівкоутворення вивчали методом O’Toole на поживному середовищі LB. Як барвник використовували генціанвіолет (BioMerieux, France). Для оцінки рівня утворення біоплівки штамом P. batumici УКМ В-321 застосовували фотометричне визначення за допомогою сканеру для планшет Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, USA); довжина хвилі 540 нм. Вплив антибіотика батуміну на рухливість бактерій вивчали на чашках Петрі з напіврідким агаром, додаючи різні концентрації антибіотика: 10, 25 і 32 мкг/мл. Як тест-штам використовували Proteus vulgaris УКМ B-905. Додатково використовували метод світлової мікроскопії, препарат «висяча крапля» та світловий мікроскоп «Мікмед-1». Хемотаксис вивчали методом Tso і Adler, вимірюючи зони на чашках Петрі. Ефектором слугував антибіотик батумін в концентраціях 20, 50 і 150 мкг/мл; тест-штам Bacillus subtilis УКМ B-7023. Результати. Встановлено, що за своїми антагоністичними властивостями штам P. batumici УКМ В-321 виявився високо активним до багатьох сапротрофних і фітопатогенних бактерій, зокрема Pectobacterium carotovorum УКМ B-1075T, Pseudomonas syringae pv. syringae УКМ B-1027T та P. fluorescens IMВ 8573, зони затримки росту яких становили 17–22 мм. Мінімальна пригнічуюча концентрація батуміну щодо різних фітопатогенних бактерій коливалася від 8 (P. carotovorum УКМ B-1075T) до 256 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis IMV 102) мкг/мл. З екстракту культуральної рідини P. batumici УКМ В-321 було виділено, охарактеризовано за фізико-хімічними та антибіотичними властивостями похідні батуміну. Окрім батуміну (молекулярна маса Mr=548, максимум спектру поглинання λ=213) в культуральній рідині виявлено: енол дезкарбамоїлбатуміну (прогнозована Mr=505, λ=226), кетодезкарбамоїлбатумін (Mr=505, λ=231), енол батуміну (Mr=548, λ=228) та 17-гідроксибатумін (Mr=550, λ=229). Найбільш антибіотично активною сполукою виявився батумін. Значно менш активними виявилися енолдезкарбамоїлбатуміну та кетодезкарбамоїлбатумін. Методом молекулярного докінгу було розраховано та експериментально підтверджено вплив батуміну на білок MotB, який є складовою частиною джгутиків грамнегативних бактерій і відповідає за їх рухливість. Встановлено, що за концентрації батуміну 10 мкг/мл відбувалось гальмування повзучого росту Proteus vulgaris УКМ В-905, а при 32 мкг/мл антибіотика повзучий ріст P. vulgaris УКМ В-905 був повністю відсутнім. Про екологічну роль батуміну засвідчував той факт, що штам-продуцент батуміну P. batumici УКМ В-321 був здатний утворювати біоплівку, а антибіотик у концентрації 1 і 10 мкг/мл стимулював цей процес. В той же час, за концентрації 20 мкг/мл він виступав позитивним ефектором (атрактантом) для ґрунтового штаму B. subtilis УКМ B-7023. Висновки. Встановлені особливості дозволяють розглядати утворюваний P. batumici УКМ В-321 антибіотик батумін як суттєвий інструмент виживання і конкурентної боротьби штама-продуцента в природних умовах.

Ключові слова: Pseudomonas batumici, батумін, біоплівкоутворення, антимікробна активність, фітопатогенні бактерії.

Повний текст (PDF, англ)