Mikrobiol. Z. 2020; 82(6):74-83.
doi: https://doi.org/10.15407/microbiolj82.06.074

Порівняння рівнів експресії гена gfp через регуляцію різними термінаторними послідовностями

О.І. Варченко^1,2, М.В. Кучук¹, М.Ф. Парій^2,3, Ю.В. Симоненко^1,2

¹Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
вул. Академіка Заболотного, 148, Київ, 03143, Україна

²Всеукраїнський науковий інститут селекції
вул. Васильківська, 30, Київ, 03022, Україна

³Національний університет біоресурсів і природокористування України
вул. Героїв Оборони, 15, Київ, 03041, Україна

Здатність рослинних клітин експресувати чужорідні гени забезпечує можливість для вивчення функцій конкретних генів. Крім того, створення генетично модифікованих рослин з новими важливими ознаками актуальне для промислового виробництва або фармацевтичних застосувань. Для високого рівня експресії гетерологічних генів одним із ключових параметрів є ефективність термінаторів, що застосовуються в генетичній інженерії, оскільки рівень експресії гена залежить від його вибору. Мета. Дослідження впливу різних термінаторів на регуляцію експресії гена gfp (зеленого флуоресцентного білка) в тканинах Nicotiana rustica L. Методи. Для створення генетичних конструкцій використовували метод модульного молекулярного клонування Golden Gate, що базується на використанні ендонуклеаз рестрикції ІІS типу та Т4 ДНК-лігази. Тканини N. rustica L. інфільтрували мануально за допомогою шприца суспензією агробактерій, що містили створені генетичні вектори для транзієнтної експресії гена gfp. Рівень експресії гена gfp визначали спектрофлуорометрично, за рівнем флуоресценції зеленого флуоресцентного білка та за білковим вмістом. Визначали концентрацію водорозчинних білків за Бредфордом та проводили їх електрофоретичне розділення у поліакриламідному гелі. Статистичну обробку даних проводили в програмі Microsoft Office Excel. Визначали середнє значення та його стандартне відхилення для кожного експерименту. Для статистичної обробки спектрофлуорометричного аналізу середнє значення визначали шляхом логарифмічного перетворення значень спектрофлуорометра. Обробку значень для визначення концентрації білків за даними поліакриламідного гелю проводили в програмі GelAnalyzer 19.1. Результати. Для дослідження створено п’ять генетичних конструкцій, що містять 5 різних термінаторів з сигналами поліаденілювання/3’-нетрансляційними послідовностями (3’UTR). Було обрано термінатори: 7-го гена, виділеного з Agrobacterium tumefaciens L. (Atug7), гена манопін синтази – з A. tumefaciens (mas), аденозин 5’-трифосфатази томатів (Solanum lycopersum L.) (АТPase), гістону H4 картоплі (Solanum tuberosum L.) та вірусу мозаїки цвітної капусти (35S CaMV). Всі транскрипційні одиниці додатково містили: 5’- нетрансляційну послідовність гена 2B сімейства генів, що кодують малу субодиницю рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази/оксигенази (Rubisco) (5’UTR RbcS2B), кодуючу послідовність гена gfp та подвійний 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (D35S CaMV). Присутність рекомбінантного білка GFP у загальних білкових екстрактах та його ідентичність стандартному білку було доведено спектрофлуорометрично та методом поліакриламідного гель-електрофорезу. Вперше була показана різниця накопичення репортерного білка GFP в тканинах N. rustica L. шляхом термінаторної регуляції експресії гена gfp. Висновки. Найвищий рівень експресії гена gfp детектували при використанні в генетичній конструкції термінатора Atug7, а найнижчий – з термінатором гістону H4. Різниця між накопиченням GFP за білковим аналізом, використовуючи Atug7 та H4 термінатори, складала 2,89 разів. Ми показали, що послідовність термінатора має високий вплив на експресію гена. Вибір термінаторів є важливим кроком у створенні генетичних конструкцій, оскільки термінатор може бути використаний для регулювання рівня експресії генів залежно від цілей.

Ключові слова: Nicotiana rustica L., молекулярне клонування, генетичні конструкції, термінатори, зелений флуоресцентний білок, транзієнтна експресія, спектрофлуорометричний аналіз, білковий аналіз.

Повний текст (PDF, англ)