Mikrobiol. Z. 2017; 79(2):33-47. Ukrainian.
doi: https://doi.org/10.15407/microbiolj79.02.033

Протеаза Streptomyces sp. 12: очищення і властивості

Нідялкова Н.А.¹, Варбанець Л.Д.¹, Шепелевич В.В.², Зелена П.П.²,
Юмина Ю.М.², Гаркава К.Г.³, Трошина Л.О.³

¹Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
вул. Академіка Заболотного, 154, Київ, 03143, Україна

²Київський національний університет ім. Тараса Шевченка
вул. Володимирська, 60, Київ, 01033, Україна

³Національний авіаційний університет
пр-т Космонавта Комарова, 1, Київ, 03680, Україна

Мета. Оптимізувати умови культивування Streptomyces sp. 12 для забезпечення максимального синтезу протеаз, одержати очищений препарат протеази, дослідити її субстратну специфічність, фізико-хімічні властивості та функціональні групи активного центру. Методи. Оптимізацію умов культивування за допомогою однофакторних експериментів проводили на базовому середовищі наступного складу(г/л): K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ ∙ 7H₂O – 1; NaCl – 1; (NH₄)₂SO₄ – 2; CaCO₃ – 2; крохмаль – 10; розчин солей мікроелементів (FeSO₄ ∙ 7H₂O – 1, MnCl₂ ∙ 4H₂O – 1, ZnSO₄ ∙ 7H2O – 1) – 1 мл. Загальну казеїнолітичну (протеолітичну) активність визначали кількісно за тирозином, що утворюється при гідролізі казеїну під дією досліджуваного ензиму. Для виділення та очищення ензиму застосовували осадження (NH₄)₂SO₄ 90 % насичення, хроматографію на нейтральних та заряджених TSK-гелях. Результати. Встановлено, що оптимальними джерелами карбону, нітрогену і мінерального живлення в поживному середовищі є кукурудзяне борошно, (NH₄)₂SO₄ і CaCl₂ відповідно. При вирощуванні Streptomyces sp. 12 в глибинних умовах культивування протягом трьох діб в 200 мл оптимізованого поживного середовища при початковому значенні рН 7,0, температурі 37 °С, швидкості обертання качалки 220 об/хв питома протеолітична активність становила 62,7 од∙мг протеїна^-1, що в 4,8 рази вище в порівнянні з контролем (базове середовище). Фракціонуванням сульфатом амонію, гель-фільтраційною та іонообмінною хроматографією на TSK-гелях – Toyopearl HW-55, DEAE 650(M) і Sepharose 6B була отримана протеаза Streptomyces sp. 12 з питомою активністю 538 од∙мг протеїна^-1 і виходом 35,8 %. Молекулярна маса протеази Streptomyces sp. 12 складала ~35,6 кДа. Показано, що ензим проявляє найвищу активність до колагену та меншу – до казеїну, альбуміну і желатину. Інгібування групоспецифічними реагентами виявило, що досліджувана протеаза є металопротеазою з оптимальними умовами дії на колаген при рН 8,0 і температурі 50 °С. Висновки. Одержана протеаза Streptomyces sp. 12 з питомою протеолітичною активністю 538 од∙мг протеїна^-1, що в 8,6 разів вище, ніж активність в супернатанті культуральної рідини.

Kлючові слова: протеаза, Streptomyces, оптимізація поживного середовища, культивування, очищення, молекулярна маса.

Повний текст (PDF, укр)